Bildbearbeitung etc.

Wegen der Halogenbeleuchtung des Mikroskops wird bei der Aufnahme wird bereits ein Weißausgleich durchgeführt!
Danach erfolgt die Bearbeitung mit Fast Stone Image Viewer:
a) Drehen, beschneiden
b) Kontrast verstärken (Tonwertkorrektur)
c) Farbsättigung erhöhen: der blaue Farbanteil wird oft erst hierdurch sichtbar
d) Nachschärfen (Unscharf Maskieren)
e) Bildgröße verringern 386x bei 72 dpi
f) Beschriften der Bilder (FSIV):
    f1) Texte: Hintergrund stark gelb, Rand = 0, Schrift Arial bold 8, Deckkraft 100%
    f2) Copyright-Zeichen = <alt> +   184 (Num-Block), Copyright-Text = Arial 8,
          Deckkraft 100%
    f3) Pfeil: Stark gelb, Breite 3, Deckkraft 100%
    f4) Hilfslinien: Stark gelb, Breite 2 (bei Bedarf 3), Deckkraft 100%
g) Bild-Import nach blogspot:
    g1) Hochformat: linksbündig, Originalgröße, Bildunterschrift
    g2) Breitformat: linksbündig, Groß, Bildunterschrift
h) Text zum Bild:
    h1) Jedes Bild bekommt einen eigenen Text.
    h2) Textformat: "Standardschriftart", "Normal", Überschriften "Zwischenüberschrift"
i) Baumfotos: 512 * xy, 72 dpi; im Blog: linksbündig, Extragroß
j) Breite der Komponenten des Blogs:
    Breite gesamter Blog: 960 Pixel, Breite Linke Sidebar: 180 Pixel

Technik

Schnitte
Handschnitte mit Rasierklinge für feine Details, also vor allem Radialschnitte (Schnittdicke ca. 20-40 µm).

Mikroskop
Olympus-BHS mit Foto-Projektiv NFK 2.5x
 
Mikroskop-Kamera
Canon EOS-600D

Bildbearbeitung
Finite State Image Viewer FSIV, The Gimp

Präparation

Anfärbung, Einbettung der Dauerpräparate

1.) Säubern, Selektieren
Die Schnitte werden von Schwebstoffen befreit, indem sie mehrfach mit sauberem Wasser gefüllte Petrischalen durchlaufen.
Schließlich werden die dünnsten und geeignetsten Schnitte selektiert.

2.) Fixieren mit dem FAE-Fixiergemisch
Dazu werden die selektierten Schnitte für mind. 1 Stunde in FAE-Fixiergemisch gelegt. Vorsicht: FAE-Gemisch enthält das giftige Formaldehyd! Während des Fixiervorgangs erfahren die Schnitte eine chem. Reaktion,  die Zellen werden abgetötet, fixiert, stabilisiert. Nach meiner Erfahrung verhindert dies auch das "Auslaufen" der Farbe beim Färbevorgang.

3.) Auswaschen des FAE-Fixiergemischs
Hierzu folgende Reihenfolge einhalten: Ethanol Ethanol 70 % (5 Min.), Ethanol 50 % (3 Min.), Ethanol 30 % (3 Min.), 3 x destill. Wasser (je 2 Min.).
N.b.: Wenn nach FAE ein Einfärben mit "Etzold" erfolgen soll, kann man dieses recht mühsame Auswaschen auch weglassen: Z.B. überführt man die fixierten Schnitte direkt in destilliertes Wasser, in dem sie wie wild herumschwimmen, und gibt sie nach fünf Minuten ins "Etzold".

Das nachfolgend beschriebene Einfärben, Auswaschen und Entwässern erfolgt vorzugsweise in den Mulden eines Mulden-Objektträgers (optimal sind 3 Mulden).
Die für die Dauerpräparate verwendeten Objektträger sollten ein aufgerautes Beschriftungsfeld besitzen. Als Deckgläschen eignen sich runde mit 15 mm Durchmesser besonders gut.

2.) Einfärben
Die selektierten Schnitte werden für 5-15 Minuten in die mit Etzold-FCA gefüllte erste Mulde gegeben. Nach dieser Zeit sind die Schnitte optimal eingefärbt. Die Einfärbung lässt sich verstärken, wenn man das Präparat mit einem Feuerzeug erhitzt. Wichtig: Bei den Tracheiden und Gefäßen färben sich nur die Zellwände  an!
Alternativ kann man Etzold mit dest. Wasser 1zu 1 verdünnen und färbt dann: 20 Min. Quer- und Tangentialschnitt, 30 Min. für Radialschnitt.

3.) Auswaschen
Die gefärbten Schnitte werden 2 x für 1 Minute in der nächsten Mulde mit dest. Wasser ausgewaschen und dadurch von überschüssigem Etzold befreit.
N.B.: Wer keine Dauerpräparate anfertigen will, kann die Schnitte jetzt in Wasser mikroskopieren und ggf. fotografieren. Das Entfärben tritt erst nach ein paar Stunden ein.

4.) Differenzieren
Sollte bei einer Sichtkontrolle am Stereomikroskop das Präparat überfärbt sein, dann muss man mit 70%-Ethanol (alternativ mit dest. Wasser verdünntes Isopropanol) die Einfärbung wieder etwas zurücknehmen. Überfärbung trat z.B. beim T-Schnitt von Pinus auf, wo das Blau der parenchymat. Markstrahlzellen den Markstrahl völlig "verschmiert". Dauer der Differenzierung: Sichtkontrolle mit dem Stereomikroskop. - Seltsamerweise verhindert 2-stündiges Kochen der Holzwürfel in Salzwasser (1 TL auf 0,5 Ltr. Wasser) die Überfärbung.

Bewährt hat sich das Folgende:
Quer- und Tangentialschnitt:
Etzold-FCA 1:1 mit H2O verdünnt: 20 Min; Differenzieren: Isopropanol-Wasser-Gemisch: 20 Sek.
Radialschnitt:
Etzold-FCA 1:1 mit H2O verdünnt: 30 Min; , Differenzieren: Isopropanol-Wasser-Gemisch: 20 Sek.

5.) Entwässern (das Eindeckharz Euparal verträgt sich nicht mit Wasser!!)
In der dritten Mulde werden die Schnitte jetzt zügig in reichlich 100%-Isopropanol (handelsübliches 99,9 Prozent reicht aus) entwässert. Diese Entwässerung erfolgt in drei Stufen, jeweils in 100-prozentigem Isopropanol: zuerst für 20 Sekunden, dann für 1 Min, abschließend für mindestens 3 Minuten. Zwischen den Stufen wird jeweils abgesaugt und mit frischem Isopropanol aufgefüllt. Im letzten Bad können die Schnitte bis zum Einbetten verbleiben.

6.) Einbetten, Dauerpräparate
Verwendet man die o.a. runden Deckgläschen mit 15 mm Durchmesser, kann man pro Objektträger drei Präparate einbetten. Dazu wird ein Schnitt mit feiner Pinzette gegriffen und mit anhängendem Isopropanol auf den Objektträger überführt. Hierbei auf korrekte xy-Ausrichtung des Schnitts achten; am besten so, dass sich beim späteren Blick durch das Mikroskop bezügl. Wuchsrichtung, Markstrahlen etc. die gewünschte Richtung ergibt.
Auf den abgelegten Schnitt gibt man einen Tropfen Euparal, nicht zu knapp bemessen.

7.) Aushärten, Austreiben eingeschlossener Luftbläschen
Auf jedem Deckgläschen wird zentral hochkant eine M8-Mutter platziert. Nach einer halben Stunde kann man die Präparate unter dem Mikroskop kurz begutachten. Danach müssen die Muttern für die etwa drei Tage dauernde Endtrocknung wieder drauf.
Verkürzung der Aushärtezeit ist z.B. in einem Joghurtbereiter bei 45 Grad über Nacht möglich!
Alternativ: Wärmeofen oder Dörrgerät.
Um eingeschlossene Bläschen auszutreiben, kann man die Präparate dazu erst einmal für 24 Stunden in eine Vakuumbox geben. Normalerweise treten aber keine Lufteinschlüsse auf!
Ganz kleine Bläschen werden im Verlauf von Tagen übrigens vom Euparal restlos absorbiert.

Lufteinzüge beseitigen
Nach etwa drei Tagen Lagerung haben die Präparate ihre volle Farb-Brillanz erreicht. Die Muttern können jetzt entfernt werden.
Sollte ein Präparat jetzt noch vom Rand her Luft nachgezogen haben, so kann man diese wegen der immer noch teigigen Konsistenz des Euparals jetzt austreiben: Zuerst wird unter dem Stereomikroskop mit einer Rasierklinge der Kanal zur innenliegenden Luftblase stark verbreitert. Dann gibt man mit Hilfe eines Zahnstochers ganz wenig frisches Euparal an eine der beiden äußersten Ecken des Luftkanals von außen an das Deckgläschen. Das Euparal zieht dadurch automatisch nach innen und ersetzt die Luftblase komplett. Bei diesem Vorgang darf das Deckgläschen nicht gedrückt werden! Danach nochmal für einen Tag die Mutter aufsetzen.

Versäubern, Beschriften, Fotografieren, Endlagerung
Mit Rasierklinge und/oder mit Isopropanol getränkten Wattestäbchen werden die Dauerpräparate von Euparalresten auf den Deckgläschen befreit. Nun können sie unter dem Mikroskop begutachtet und fotografiert werden. Beim Fotografieren direkt den Weißabgleich durchführen!
Die Beschriftung sollte Folgendes enthalten: Präparat - Färbemittel - Einschlussmittel - Name des Präparators - Datum - lfd. Nr. (z.B. "Abies 3xQ - Etzold-FCA - Euparal - H. Westermann - 27.12.2015 - Nr. 413").
Endgültig gelagert werden die Dauerpräparate in entsprechenden Präparateboxen, aber so, dass die Präparate waagerecht, Deckgläser nach oben, zu liegen kommen. Hintergrund: Euparal härtet erst nach mehreren Monaten unter dem Deckgläschen völlig aus!

Vorzüge von Etzold-FCA
Dieses Einfärbemittel ergibt zum einen eine hohe Farbbrillanz und zum anderen eine selektive Zweifach-Färbung, durch die sich die verholzenden (Rotfärbung) von den nicht verholzenden (Blaufärbung) Zelltypen des Xylems unterscheiden lassen. So färben sich also Längs- und Quertracheiden rot, wohingegen sich Längs- und Quer-Parenchym sowie Epithelzellen blau verfärben. Dieser Selektionseffekt lässt sich durch geeignete Bildverarbeitung (Erhöhung der Farbsättigung) weiter verstärken.

Vorzüge von Euparal
Gegenüber z.B. Hydromatrix besitzt Euparal folgende Vorzüge:
1) Es ergeben sich brillantere Farben.
2) Es kommt zu keinem Ausblassen der Etzold-Färbung über Jahre.
3) Euparal besitzt die Eigenschaft, kleine, eingeschlossene Luftblasen zu absorbieren.
4) Durch Schrumpfung bedingte Lufteinzüge, die sich in den ersten ein bis zwei Tagen nach dem Einbetten ergeben können, sind nachträglich noch gut zu beseitigen. Dies kommt daher, weil Euparal  immer noch teigige Konsistenz aufweist und da immer noch ein offener "Kanal" zwischen Deckglas-Berandung und Lufteinschluss vorhanden ist.
5) Euparal-Reste lassen sich mit Isopropanol wieder auflösen.

Erläuterungen

Abkürzungen
D: Durchmesser
EDB: Einfache Durchbrechung
EZ: Epithelzellen
ET: Einfache Tüpfel
FET: Fenstertüpfel
FG: Frühholz-Gefäß
FT: Frühholz-Tracheide
JG: Jahresringgrenze
HK: Harzkanal
HS: Holzstrahl/Markstrahl
HOT: Hoftüpfel
KF: Kreuzfeld
KNO: Knoten, Knötchen
KT Kreuzfeld-Tüpfel
KZ: Kantenzellen, Kantenzellreihen
LDB: Leiterförmige Durchbrechung
LT: Längstracheide, oft auch nur als "Tracheide" bezeichnet
MTTQ: Markstrahl-Tracheiden-Tüpfel quergeschnitten
MS: siehe HS
PCT: Piceoide Tüpfel
PO: Porus
Q: Querschnitt
R: Radialschnitt
RW: Randwulst
SG: Spätholz-Gefäß
ST: Spätholz-Tracheide
SV: Schraubenverdickung
T: Tangentialschnitt
TAT: Taxodioide Tüpfel (Abies)
TO: Torus
TTQ: (Längs-)Tracheiden-Tüpfel quergeschnitten


Erläuterungen

Etzold-FCA (Fuchsin, Chrysoidin und Astrablau): Lignifizierte (verholzte) Zellwände färben sich rot, nicht lignifizierte Wände (von Parenchymzellen, Epithelzellen der Harzkanäle) blau. Weiterentwicklung von FSA.

Etzold-FSA (Fuchsin, Safranin, Astrablau):  Lignifizierte (verholzte) Zellwände färben sich rot, nicht lignifizierte Wände(von Parenchymzellen, Epithelzellen der Harzkanäle) blau.

Etzold-Grün (Fuchsin, Chrysoidin, Alciangrün): Lignifizierte (verholzte) Zellwände färben sich rot, nicht lignifizierte Wände (von Parenchymzellen, Epithelzellen der Harzkanäle) grün.

heterozellular:  Als heterozellular bezeichnet man Markstrahlen von Nadelhölzern, bei denen die äußeren Zellreihen (Kantenzellreihen) aus sogen. Quer- oder Markstrahltracheiden bestehen. Die übrigen, innen liegenden Reihen bestehen aus parenchymatische Zellen.
Mit Etzold-FCA färben sich Quertracheiden rot, die parenchymatischen Zellreihen blau.
Relevante Holzarten mit heterozellularen Markstrahlen sind Picea, Pinus, Larix und Pseudotsuga.
Anstelle von "Markstrahlen heterozellular" wird in der Literatur mitunter der Ausdruck "Markstrahlen mit Tracheiden" verwendet.

homozellular: Als homozellular bezeichnet man Markstrahlen von Nadelhölzern, die nur aus parenchymatischen Zellen bestehen.
Hier färbt sich mit Etzold-FCA folglich der komplette Markstrahl blau.
Relevante Holzarten mit homozellularen Markstrahlen sind Abies, Juniperus und Taxus.
Anstelle von "Markstrahlen homozellular" wird in der Literatur mitunter der Ausdruck "Markstrahlen ohne Tracheiden" verwendet.

Abies alba - Weißtanne

Weißtanne am Wilden See - Ruhestein 2013 - Foto B. Miggel

Verwendetes Holz: Ein 9 cm dickes, frisches Aststück

Dauerpräparate (Etzold-FCA, Euparal):
Q: 413, 414, 415
T: 416, 417
R: 418, 419

Der Querschnitt Q: 

Abb. 1a: Abies-Q, Überblick

Abb. 1a zeigt, wie für Nadelholz charakteristisch, nur Tracheiden. Sie besitzen einen rundlich-eckigen Querschnitt. Der Pfeil gibt die Wuchsrichtung an. Man erkennt weitlumige, dünnwandige, ca. 40 µm breite Frühholz-Tracheiden FT und einglumige, dickwandige, ca. 20 µm breite Spätholz-Tracheiden ST. Oberhalb der Mittel horizontal eine Jahresringgrenze JG, vertikal etliche, sehr dünne Markstrahlen MS. Harzkanäle sind nicht vorhanden; diese hat Abies nur in gestörten Bereichen des Holzgewebes ("Traumatischem Gewebe").
Der Übergang vom Frühholz zum Spätholz erfolgt gleitend.

Abb. 1b: Abies-Q, mit Längs-Parenchymzelle

Abb. 1b zeigt einen Querschnitts-Ausschnitt. Hier ist eine der bei Abies recht seltenen Längs-Parenchymzellen PZ im Schnitt zu sehen, die sich mit Etzold-FCA schön blau färbt. Auch die beiden Markstrahlen MS, bei Abies rein parenchymatisch, färben sich blau.

Abb. 1c: Abies-Q, mehrere Hoftüpfel quergeschnitten

Abb. 1c zeigt die quergeschnittenen Hoftüpfel, über die die Tracheiden (hier Frühholz-Tracheiden) miteinander verbunden sind TTQ. Diese Tüpfel, die man eigentlich as "doppelt behöfte Tüpfel" bezeichnen sollte, befinden sich vorwiegend an den Radialwänden der Tracheiden.

Abb. 1d: Abies-Q, quergeschnittene Hoftüpfel im Detail

In Abb.1d wird ein solcher Hoftüpfel im Detail gezeigt. Deutlich unterscheidbar sind sind Randwulst RW (Behöfung), Porus PO (Öffnung, Apertur) sowie Torus TO (innenliegende Membran).

Der Tangentialschnitt T:

Abb. 2: Abies-T, frontal geschnittene Markstrahlen

Abb. 2 zeigt in vertikaler Richtung die Längstracheiden LT, mit Zellwänden in Rot, also verholzendem Gewebe. Die frontal geschnittenen Markstrahlen MS sind im wesentlichen 1-reihig, wie das bei unseren einheimischen Nadelhölzern üblich ist. Die Höhe der Markstrahlen variiert zwischen 1 und 35 Zellen, meist allerdings zwischen 5 und 30 Zellen. Die Wände sämtlicher Zellen der Markstrahlen, inklusive der außen liegenden Kantenzellen KZ, sind deutlich blau gefärbt, bestehen also aus parenchymatischem, nicht verholzendem Gewebe.
Harzkanäle sind keine vorhanden.

 

Der Radialschnitt R:

Abb. 3a: Abies-R, Hoftüpfel

Abb. 3a zeigt vertikal eine Jahresringgrenze JG, links davon Frühholzgefäße mit 1-reihigen Hoftüpfeln HOT, rechts davon Spätholzgefäße.
Pfeil = Wuchsrichtung. Wir blicken auf die Radialwände der Tracheiden.
Horizontal der obere Bereich eines längsgeschnittenen Markstrahls MS.

Abb. 3b: Abies-R, Kantenzellenreihen des Markstrahls

Abb. 3b: ein 10 Zellreihen hoher Markstrahl im Detail. Sehr deutlich die Dickwandigkeit sowohl der Horizontalwände als auch der Tangentialwände (Endwände) der MS-Zellen. Wegen der Blaufärbung sämtlicher Zellwände, inkl. der der Kantenzellreihenen KZ, bestätigt sich, Abies-Markstrahlen bestehen nur aus parenchymatischen Zellen, sind also homozellular. 

Abb. 3c: Abies-R,Einfache Tüpfel

Abb. 3c: Durch die zahlreichen Einfachen Tüpfel  ET zwischen benachbarten Parenchymzellen nehmen letztere ein igelartiges Aussehen an. Dies nennt man "zahnradartig" oder "geknotet".

Abb. 3d: Abies-R, Kreuzfeldtüpfel = taxodioid

Abb. 3d (Ölimmersion) zeigt, dass es sich im Kreuzfeld bei Abies um taxodioide Tüpfel TAT handelt: der Porus (Apertur) ist bei ihnen i.a. breiter als der Randwulst.

Abb. 3e: Abies-R,Markstrahl mit prismatischen Kristallen

Abb. 3e: Hier ist ein 1 Zellen hoher Markstrahl mit etlichen prismatischen Kristallen zu sehen. Dies kommt bei Abies ab und zu vor.